En el laboratorio llega una muestra para su análisis, lo que lleva al analista a preparar el sistema de HPLC para una evaluación rutinaria. Aunque el método ha estado funcionando correctamente, la presión del sistema se dispara inesperadamente tras la primera inyección y vuelve a hacerlo con la segunda. A pesar de la claridad de la muestra y de la correcta preparación de la fase móvil, la presión es anómalamente alta. Este tipo de situaciones son habituales en los laboratorios, sobre todo al manipular muestras complejas o al mantener un programa de análisis muy ajetreado. En esta situación, el analista debe inspeccionar no solo la columna y la preparación de la muestra, sino también el Columna de protección para HPLC, accesorios, tubos y otros puntos de conexión.
En un primer momento, se podría sospechar que hay una obstrucción en la columna de HPLC que requiere su sustitución. Sin embargo, no siempre la culpa es de la columna analítica. Pueden producirse síntomas similares debido a partículas finas en la muestra, una columna de protección contaminada, sales tampón precipitadas u obstrucciones en el inyector y los tubos. Sustituir la columna sin identificar la causa raíz podría dar lugar a problemas recurrentes con las columnas posteriores.
Una causa frecuente de obstrucción es la contaminación procedente de la fase móvil. Las partículas minúsculas procedentes de disolventes, soluciones tampón, material de vidrio, depósitos o conductos de disolvente pueden infiltrarse en el sistema y acumularse en el filtro de la entrada de la columna. Este problema puede desarrollarse de forma gradual y pasar desapercibido hasta que se produzca un aumento notable de la presión. Filtrar la fase móvil mediante una membrana de 0,22 o 0,45 µm, tapar los frascos de disolventes y limpiar regularmente los depósitos puede mitigar este riesgo.
La preparación adecuada de las muestras es igualmente fundamental. Las muestras pueden contener proteínas, aceites, polímeros, excipientes, compuestos no disueltos u otros elementos de la matriz. Incluso las partículas invisibles pueden acumularse en la entrada de la columna tras numerosas inyecciones. Por lo general, las muestras deben centrifugarse y filtrarse antes de la inyección, y es posible que las muestras concentradas o complejas requieran dilución. Un aspecto transparente no garantiza que la muestra esté libre de partículas.
El disolvente de la muestra también puede provocar problemas. Si una muestra se prepara en un disolvente orgánico fuerte, podría producirse una precipitación al introducirla en una fase móvil inicial que sea principalmente acuosa. El precipitado resultante puede acumularse cerca de la entrada de la columna, provocando un aumento de la presión. Para evitarlo, asegúrese de que los disolventes de las muestras sean compatibles con la fase móvil inicial y mantenga los volúmenes de inyección dentro de límites razonables, especialmente si los problemas de presión se limitan a una muestra o método concretos.
La precipitación de sales tampón suele provocar aumentos repentinos de presión. Esta situación puede producirse al pasar directamente de una fase móvil tamponada a otra con un alto contenido en metanol o acetonitrilo. Para evitar estos problemas, se recomienda purgar el sistema con un disolvente compatible y sin sales antes de pasar a disolventes con alto contenido en compuestos orgánicos. Esta precaución es fundamental cuando se trabaja con fosfato concentrado u otros tampones con solubilidad limitada en mezclas orgánicas.
Una presión elevada no siempre indica que la columna analítica esté dañada. Para localizar una obstrucción, detenga la bomba, espere a que la presión baje a cero, desconecte la columna analítica, conecte el sistema mediante un racor adecuado y vuelva a poner en marcha la bomba a un caudal reducido. Si la presión se normaliza sin la columna, compruebe la columna analítica, la columna de protección y el filtro de entrada. Si la presión sigue siendo elevada, examine el inyector, el asiento de la aguja, el bucle de muestra, los tubos, el filtro en línea, la salida de la bomba y la celda de flujo del detector.
El seguimiento de las tendencias de presión puede resultar revelador. Un aumento gradual suele indicar una acumulación de contaminación debida a inyecciones repetidas, mientras que un pico repentino suele apuntar a la presencia de partículas, a la precipitación de sales tampón o a una frita de entrada obstruida. Si se produce una presión elevada únicamente con un método, revisa la composición de la fase móvil, la concentración del tampón, el disolvente de la muestra y el volumen de inyección. Por el contrario, si afecta a todos los métodos, revise todos los componentes comunes a la trayectoria de flujo de la HPLC.
Si se sospecha que una columna está obstruida, detén los procesos de inyección y reduce el caudal. En primer lugar, revisa la columna de protección y sustitúyela si es necesario, ya que la contaminación en esta zona puede simular problemas en la columna analítica al provocar una presión elevada. Siga las instrucciones del fabricante para cualquier limpieza necesaria, utilizando únicamente disolventes adecuados. Aunque algunas columnas permiten el lavado inverso para eliminar partículas del filtro de entrada, hágalo solo si el fabricante lo recomienda explícitamente.
Comprender las tendencias de presión puede aportar información valiosa. Un aumento gradual suele indicar una acumulación de contaminación debida a inyecciones repetidas, mientras que un aumento repentino suele apuntar a problemas como la obstrucción por partículas, la precipitación de sales tampón o una frita de entrada obstruida. Si se observa una presión elevada con un método concreto, comprueba la composición de la fase móvil, la concentración del tampón, el disolvente de la muestra y el volumen de inyección. Si ocurre en todos los métodos, céntrate en los componentes comunes de toda la trayectoria de flujo de la HPLC.
Si se sospecha que una columna está obstruida, interrumpa las inyecciones y reduzca el caudal. Comience por comprobar la columna de protección; su sustitución podría resolver los problemas de alta presión que a menudo se confunden con problemas de la columna analítica. Si es necesario limpiarla, siga las instrucciones del fabricante de la columna y utilice únicamente disolventes compatibles. Algunas columnas permiten realizar un lavado inverso para eliminar partículas del filtro de entrada, pero esto solo debe hacerse si el fabricante lo autoriza expresamente. Si la presión sigue siendo anómala tras estas comprobaciones, revise los tubos y las conexiones, o consulte a un Proveedor de accesorios para HPLC para componentes de recambio compatibles.