Au laboratoire, un échantillon arrive pour être analysé, ce qui amène l’analyste à préparer le système HPLC en vue d’une analyse de routine. Bien que la méthode ait fonctionné correctement jusqu’à présent, la pression du système connaît des pics inattendus après la première injection, puis à nouveau lors de la deuxième. Malgré la limpidité de l’échantillon et la préparation correcte de la phase mobile, la pression reste anormalement élevée. De tels incidents sont courants dans les laboratoires, notamment lors du traitement d’échantillons complexes ou dans le cadre d’un calendrier d’analyses très chargé. Dans cette situation, l’analyste doit inspecter non seulement la colonne et la préparation de l’échantillon, mais également le Colonne de garde HPLC, les raccords, les tuyaux et autres points de raccordement.
Au premier abord, on pourrait soupçonner un colmatage de la colonne HPLC nécessitant son remplacement. Cependant, la colonne analytique n’est pas toujours en cause. Des symptômes similaires peuvent être dus à la présence de particules fines dans l'échantillon, à une colonne de garde contaminée, à des sels tampons précipités ou à des obstructions au niveau de l'injecteur et de la tuyauterie. Remplacer la colonne sans identifier la cause profonde du problème pourrait entraîner des problèmes récurrents avec les colonnes suivantes.
Une cause fréquente d'obstruction est la contamination provenant de la phase mobile. De minuscules particules issues des solvants, des solutions tampons, de la verrerie, des réservoirs ou des conduites de solvants peuvent s'infiltrer dans le système et se loger au niveau de la fritte d'entrée de la colonne. Ce problème peut se développer progressivement et passer inaperçu jusqu'à ce qu'une augmentation notable de la pression se produise. Filtrer la phase mobile à l'aide d'une membrane de 0,22 ou 0,45 µm, recouvrir les flacons de solvants et nettoyer régulièrement les réservoirs permet d'atténuer ce risque.
Une préparation adéquate des échantillons est tout aussi essentielle. Les échantillons peuvent contenir des protéines, des huiles, des polymères, des excipients, des composés non dissous ou d’autres éléments de la matrice. Même des particules invisibles peuvent s’accumuler à l’entrée de la colonne après de nombreuses injections. En règle générale, les échantillons doivent être centrifugés et filtrés avant l’injection ; les échantillons concentrés ou complexes pouvant nécessiter une dilution. Un aspect limpide ne garantit pas l’absence de particules dans l’échantillon.
Le solvant de l'échantillon peut également être à l'origine de problèmes. Si un échantillon est préparé dans un solvant organique puissant, une précipitation peut se produire lors de son introduction dans une phase mobile initiale essentiellement aqueuse. Le précipité ainsi formé peut s’accumuler près de l’entrée de la colonne, entraînant une augmentation de la pression. Pour éviter cela, assurez-vous que les solvants des échantillons sont compatibles avec la phase mobile initiale et maintenez les volumes d’injection dans des limites raisonnables, en particulier si les problèmes de pression se limitent à un échantillon ou à une méthode spécifique.
La précipitation des sels tampons entraîne souvent des hausses brusques de pression. Cette situation peut se produire lors du passage direct d'une phase mobile tamponnée à une phase à forte teneur en méthanol ou en acétonitrile. Pour éviter ce genre de problème, rincez le système avec un solvant compatible et exempt de sel avant de passer à des solvants à forte teneur en composés organiques. Cette précaution est essentielle lorsque vous utilisez du phosphate concentré ou d’autres tampons présentant une solubilité limitée dans les mélanges organiques.
Une pression élevée n’indique pas nécessairement que la colonne analytique elle-même est endommagée. Pour localiser un point d’obstruction, arrêtez la pompe, attendez que la pression tombe à zéro, débranchez la colonne analytique, raccordez le système à l’aide d’un raccord approprié, puis redémarrez la pompe à un débit réduit. Si la pression revient à la normale sans la colonne, examinez la colonne analytique, la colonne de protection et la fritte d’entrée. Si la pression reste élevée, examinez l’injecteur, le siège d’aiguille, la boucle d’échantillonnage, la tuyauterie, le filtre en ligne, la sortie de la pompe et la cellule de débit du détecteur.
Le suivi de l'évolution de la pression peut être révélateur. Une augmentation progressive indique généralement une accumulation de contamination due à des injections répétées, tandis qu'un pic soudain est souvent le signe de la présence de particules, d'une précipitation de sels tampons ou d'un filtre d'entrée obstrué. Si une pression élevée n'apparaît qu'avec une seule méthode, vérifiez la composition de la phase mobile, la concentration du tampon, le solvant de l'échantillon et le volume d'injection. À l’inverse, si ce phénomène affecte toutes les méthodes, inspectez tous les composants communs au circuit de la HPLC.
En cas de suspicion d'obstruction de la colonne, interrompez les processus d'injection et réduisez le débit. Commencez par inspecter la colonne de protection et remplacez-la si nécessaire, car une contamination à ce niveau peut simuler des problèmes au niveau de la colonne analytique en provoquant une pression élevée. Respectez les instructions du fabricant pour tout nettoyage nécessaire et n'utilisez que des solvants adaptés. Bien que certaines colonnes permettent un rinçage à contre-courant pour éliminer les particules de la fritte d'entrée, ne procédez ainsi que si cela est explicitement recommandé par le fabricant.
La compréhension des tendances de pression peut fournir des informations précieuses. Une augmentation progressive indique généralement une accumulation de contamination due à des injections répétées, tandis qu’une hausse soudaine suggère souvent des problèmes tels qu’une obstruction par des particules, la précipitation de sels tampons ou un filtre d’entrée bouché. Si une pression élevée est observée avec une méthode spécifique, examinez la composition de la phase mobile, la concentration du tampon, le solvant de l’échantillon et le volume d’injection. Si ce phénomène se produit avec toutes les méthodes, concentrez-vous sur les composants communs à l’ensemble du circuit de l’HPLC.
Si vous soupçonnez un colmatage de la colonne, interrompez les injections et réduisez le débit. Commencez par vérifier la colonne de garde ; son remplacement pourrait résoudre les problèmes de haute pression souvent confondus avec des dysfonctionnements de la colonne analytique. Si un nettoyage s’avère nécessaire, respectez les consignes du fabricant de la colonne et n’utilisez que des solvants compatibles. Certaines colonnes peuvent permettre un rinçage à contre-courant pour éliminer les particules de la fritte d'entrée, mais cette opération ne doit être effectuée que si elle est explicitement autorisée par le fabricant. Si la pression reste anormale après ces vérifications, inspectez les tubulures et les raccords, ou consultez un Fournisseur de raccords pour HPLC pour des pièces de rechange compatibles.