実験室に分析用の試料が到着すると、分析担当者は定例評価のためにHPLCシステムの準備を始める。これまでこの分析法は正常に機能していたが、最初の注入後にシステムの圧力が予期せず急上昇し、2回目の注入時にも同様の現象が見られた。 試料は澄んでおり、移動相も正しく調製されているにもかかわらず、圧力が異常に高くなっている。このような現象は、特に複雑な試料を扱う場合や、多忙な試験スケジュールをこなしている場合、実験室ではよく見られる。この状況では、分析担当者はカラムや試料調製だけでなく、以下の点についても点検すべきである。 HPLCガードカラム, 、継手、チューブ、およびその他の接続箇所。.
最初は、HPLCカラムの目詰まりが原因であり、交換が必要だと疑うかもしれません。しかし、必ずしも分析カラムに問題があるとは限りません。 同様の症状は、試料中の微粒子、ガードカラムの汚染、緩衝液中の塩の沈殿、あるいはインジェクターや配管内の閉塞によっても引き起こされる可能性があります。根本原因を特定せずにカラムを交換すると、その後のカラムでも同様の問題が繰り返し発生する恐れがあります。.
目詰まりのよくある原因の一つは、移動相による汚染です。溶媒、緩衝液、ガラス器具、リザーバー、あるいは溶媒ラインからの微細な粒子がシステム内に侵入し、カラムの入口フリットに付着することがあります。この問題は徐々に進行し、顕著な圧力上昇が見られるまで気づかれない場合があります。 0.22 または 0.45 µm の膜を用いて移動相をろ過し、溶媒ボトルに蓋をし、リザーバーを定期的に洗浄することで、このリスクを軽減することができます。.
適切な試料前処理も同様に重要です。 試料には、タンパク質、油分、高分子、賦形剤、未溶解化合物、その他のマトリックス成分が含まれている可能性があります。目に見えない粒子であっても、何度も注入を繰り返すとカラム入口に蓄積することがあります。通常、試料は注入前に遠心分離とろ過を行う必要があり、濃度の高い試料や複雑な試料については希釈が必要になる場合があります。外観が澄んでいても、粒子が含まれていないとは限りません。.
試料の溶媒も問題を引き起こす可能性があります。試料が強力な有機溶媒で調製されている場合、主に水からなる初期の移動相に導入された際に沈殿が生じる可能性があります。 その結果生じた沈殿物がカラムの入口付近に蓄積し、圧力が上昇する原因となる可能性があります。これを回避するには、サンプル溶媒が初期移動相と適合していることを確認し、特に圧力の問題が特定のサンプルやメソッドに限定されている場合は、注入量を妥当な範囲内に抑えるようにしてください。.
緩衝塩の沈殿は、しばしば急激な圧力上昇を引き起こします。この現象は、緩衝液を含む移動相から、メタノールやアセトニトリルの含有量が高い移動相へ直接切り替える際に発生することがあります。 このような問題を防止するには、高有機溶媒に切り替える前に、互換性があり塩分を含まない溶媒でシステムを洗浄してください。この予防措置は、高濃度のリン酸緩衝液や、有機混合物への溶解度が限られているその他の緩衝液を使用する場合に特に重要です。.
圧力が上昇しても、必ずしも分析カラム自体に損傷があるとは限りません。閉塞箇所を特定するには、ポンプを停止し、圧力がゼロになるまで待ってから、分析カラムを取り外し、適切なユニオンでシステムを接続し、流量を下げた状態でポンプを再起動してください。 カラムを外した状態で圧力が正常に戻る場合は、分析カラム、ガードカラム、およびインレットフリットを点検してください。高圧状態が続く場合は、インジェクター、ニードルシート、サンプルループ、チューブ、インラインフィルター、ポンプ出口、および検出器のフローセルを点検してください。.
圧力の推移を監視することは、有益な知見をもたらすことがあります。圧力が徐々に上昇する場合は、通常、繰り返しの注入によって汚染物質が蓄積していることを示しており、一方、急激な上昇は、粒子、緩衝塩の沈殿、あるいはインレットフリットの目詰まりを示唆していることが多いです。特定の測定法でのみ高圧が発生する場合は、移動相の組成、緩衝液の濃度、試料溶媒、および注入量を確認してください。 逆に、すべての分析法で同様の現象が見られる場合は、HPLCの流路に共通するすべての構成部品を点検してください。.
カラムの目詰まりが疑われる場合は、注入プロセスを停止し、流速を下げてください。まずガードカラムを点検し、必要に応じて交換してください。ガードカラムの汚染は、高圧を引き起こすことで分析カラムの問題と似た症状を示すことがあるためです。 必要な洗浄を行う際は、メーカーの指示に従い、適切な溶媒のみを使用してください。一部のカラムでは、インレットフリットから粒子を除去するために逆流洗浄が可能ですが、これはメーカーが明示的に推奨している場合にのみ行ってください。.
圧力の変化傾向を把握することで、貴重な知見が得られます。圧力が徐々に上昇する場合は、通常、繰り返しの注入によって汚染物質が蓄積していることを示していますが、急激な上昇は、粒子による閉塞、緩衝液の塩の析出、あるいはインレットフリットの目詰まりなどの問題を示唆することがよくあります。特定の実験法で高圧が観測された場合は、移動相の組成、緩衝液の濃度、試料溶媒、および注入量を点検してください。 すべての測定法で同様の現象が見られる場合は、HPLCの流路全体に共通する構成要素に焦点を当てて調査してください。.
カラムの目詰まりが疑われる場合は、それ以上の注入を中止し、流速を下げてください。まずガードカラムを確認してください。ガードカラムを交換することで、分析カラムの問題と誤認されがちな高圧の問題が解決する場合があります。洗浄が必要な場合は、カラムメーカーのガイドラインに従い、互換性のある溶媒のみを使用してください。 一部のカラムでは、インレットフリットから粒子を除去するために逆洗浄が可能ですが、これはメーカーが明示的に許可している場合にのみ実施してください。これらの確認を行っても圧力が異常なままである場合は、チューブや接続部を点検するか、信頼できる専門家に相談してください。 HPLC用継手のサプライヤー 互換性のある交換用部品について。.