Im Labor trifft eine Probe zur Analyse ein, woraufhin der Analytiker das HPLC-System für eine Routineuntersuchung vorbereitet. Obwohl die Methode bisher einwandfrei funktioniert hat, kommt es nach der ersten Injektion und erneut bei der zweiten zu unerwarteten Druckspitzen im System. Trotz der Klarheit der Probe und der korrekten Vorbereitung der mobilen Phase ist der Druck ungewöhnlich hoch. Solche Vorkommnisse sind in Laboren an der Tagesordnung, insbesondere bei der Bearbeitung komplexer Proben oder bei einem hektischen Testplan. In dieser Situation sollte der Analytiker nicht nur die Säule und die Probenvorbereitung überprüfen, sondern auch die HPLC-Schutzsäule, Armaturen, Schläuche und andere Anschlussstellen.
Zunächst könnte man vermuten, dass die HPLC-Säule verstopft ist und ausgetauscht werden muss. Allerdings ist nicht immer die Analysesäule schuld. Ähnliche Symptome können durch feine Partikel in der Probe, eine verunreinigte Schutzsäule, ausgefällte Puffersalze oder Verstopfungen im Injektor und in den Schläuchen verursacht werden. Ein Austausch der Säule ohne Ermittlung der eigentlichen Ursache könnte zu wiederkehrenden Problemen bei nachfolgenden Säulen führen.
Eine häufige Ursache für Verstopfungen ist die Verunreinigung durch die mobile Phase. Winzige Partikel aus Lösungsmitteln, Pufferlösungen, Glasgeräten, Vorratsbehältern oder Lösungsmittelleitungen können in das System eindringen und sich an der Fritte am Säuleneinlass festsetzen. Dieses Problem kann sich schleichend entwickeln und unbemerkt bleiben, bis ein spürbarer Druckanstieg auftritt. Das Filtern der mobilen Phase mit einer 0,22- oder 0,45-µm-Membran, das Verschließen von Lösungsmittelflaschen und die regelmäßige Reinigung der Vorratsbehälter können dieses Risiko mindern.
Eine ordnungsgemäße Probenvorbereitung ist ebenso entscheidend. Proben können Proteine, Öle, Polymere, Hilfsstoffe, ungelöste Verbindungen oder andere Matrixbestandteile enthalten. Selbst unsichtbare Partikel können sich nach zahlreichen Injektionen am Säuleneinlass ansammeln. In der Regel sollten Proben vor der Injektion zentrifugiert und filtriert werden, wobei konzentrierte oder komplexe Proben möglicherweise verdünnt werden müssen. Ein klares Aussehen garantiert keine partikelfreie Probe.
Auch das Probenlösungsmittel kann Probleme verursachen. Wird eine Probe in einem starken organischen Lösungsmittel aufbereitet, kann es beim Eintritt in eine anfänglich überwiegend wässrige mobile Phase zu einer Ausfällung kommen. Der dabei entstehende Niederschlag kann sich in der Nähe des Säuleneinlasses ansammeln und zu einem Druckanstieg führen. Um dies zu vermeiden, sollten Sie sicherstellen, dass die Probenlösungsmittel mit der anfänglichen mobilen Phase kompatibel sind, und die Injektionsvolumina in einem angemessenen Rahmen halten – insbesondere, wenn Druckprobleme nur bei einer bestimmten Probe oder Methode auftreten.
Die Ausfällung von Puffersalzen führt häufig zu plötzlichen Druckanstiegen. Diese Situation kann auftreten, wenn direkt von einer gepufferten mobilen Phase auf eine mobile Phase mit hohem Methanol- oder Acetonitrilgehalt umgestellt wird. Um solche Probleme zu vermeiden, sollte das System vor dem Wechsel zu Lösungsmitteln mit hohem organischem Anteil mit einem kompatiblen, salzfreien Lösungsmittel gespült werden. Diese Vorsichtsmaßnahme ist besonders wichtig, wenn mit konzentrierten Phosphatpuffern oder anderen Puffern gearbeitet wird, die in organischen Gemischen nur begrenzt löslich sind.
Ein erhöhter Druck deutet nicht zwangsläufig auf eine Beschädigung der Analysesäule selbst hin. Um eine Verengung zu lokalisieren, schalten Sie die Pumpe aus, warten Sie, bis der Druck auf Null gesunken ist, trennen Sie die Analysesäule, schließen Sie das System mit einer geeigneten Verschraubung an und starten Sie die Pumpe mit einer reduzierten Durchflussrate neu. Wenn sich der Druck ohne die Säule normalisiert, überprüfen Sie die Analysesäule, die Schutzsäule und die Einlassfritte. Bleibt der hohe Druck bestehen, überprüfen Sie den Injektor, den Nadelsitz, die Probenschleife, die Schläuche, den Inline-Filter, den Pumpenausgang und die Detektor-Durchflusszelle.
Die Beobachtung von Druckverläufen kann aufschlussreich sein. Ein allmählicher Anstieg deutet in der Regel auf eine durch wiederholte Injektionen verursachte Kontaminationsansammlung hin, während ein plötzlicher Anstieg oft auf Partikel, die Ausfällung von Puffersalzen oder eine verstopfte Einlassfritte hindeutet. Tritt der hohe Druck ausschließlich bei einer Methode auf, überprüfen Sie die Zusammensetzung der mobilen Phase, die Pufferkonzentration, das Probenlösungsmittel und das Injektionsvolumen. Betrifft der hohe Druck hingegen alle Methoden, überprüfen Sie alle Komponenten, die im HPLC-Fließweg gemeinsam sind.
Bei Verdacht auf eine verstopfte Säule sollten Sie die Injektionsvorgänge unterbrechen und die Durchflussrate verringern. Überprüfen Sie zunächst die Schutzsäule und tauschen Sie sie gegebenenfalls aus, da Verunreinigungen hier Probleme mit der Analysesäule vortäuschen können, indem sie einen hohen Druck verursachen. Befolgen Sie bei einer eventuell erforderlichen Reinigung die Anweisungen des Herstellers und verwenden Sie ausschließlich geeignete Lösungsmittel. Obwohl bei einigen Säulen eine Rückwärtsspülung möglich ist, um Partikel aus der Einlassfritte zu entfernen, sollten Sie dies nur tun, wenn es vom Hersteller ausdrücklich empfohlen wird.
Das Verständnis von Druckverläufen kann wertvolle Erkenntnisse liefern. Ein allmählicher Anstieg deutet in der Regel auf eine zunehmende Verunreinigung durch wiederholte Injektionen hin, während ein plötzlicher Anstieg häufig auf Probleme wie Partikelverstopfungen, die Ausfällung von Puffersalzen oder eine verstopfte Einlassfritte hindeutet. Wenn bei einer bestimmten Methode ein hoher Druck beobachtet wird, sollten Sie die Zusammensetzung der mobilen Phase, die Pufferkonzentration, das Probenlösungsmittel und das Injektionsvolumen überprüfen. Tritt das Problem bei allen Methoden auf, konzentrieren Sie sich auf die gemeinsamen Komponenten des gesamten HPLC-Flusswegs.
Bei Verdacht auf eine verstopfte Säule sollten Sie weitere Injektionen unterbrechen und die Durchflussrate verringern. Überprüfen Sie zunächst die Vorsäule; deren Austausch kann Probleme mit hohem Druck beheben, die oft fälschlicherweise als Probleme mit der Analysesäule interpretiert werden. Sollte eine Reinigung erforderlich sein, halten Sie sich an die Richtlinien des Säulenherstellers und verwenden Sie ausschließlich kompatible Lösungsmittel. Bei bestimmten Säulen ist möglicherweise eine Rückwärtsspülung zulässig, um Partikel aus der Einlassfritte zu entfernen; dies sollte jedoch nur erfolgen, wenn es vom Hersteller ausdrücklich erlaubt ist. Sollte der Druck nach diesen Überprüfungen weiterhin abnormal sein, überprüfen Sie die Schläuche und Anschlüsse oder wenden Sie sich an einen zuverlässigen Anbieter von HPLC-Fittings für kompatible Ersatzteile.