В лабораторию поступает образец для анализа, и аналитик приступает к подготовке системы ВЭЖХ к проведению планового исследования. Несмотря на то что метод ранее работал исправно, давление в системе неожиданно скачет после первой инъекции и повторно — после второй. Несмотря на прозрачность пробы и правильную подготовку подвижной фазы, давление остается аномально высоким. Подобные ситуации часто возникают в лабораториях, особенно при работе со сложными пробами или при выполнении напряжённого графика испытаний. В такой ситуации аналитику следует проверить не только колонку и подготовку пробы, но и Защитная колонка для ВЭЖХ, фитинги, трубки и другие соединительные узлы.
Сначала можно заподозрить закупорку ВЭЖХ-колонки, требующую её замены. Однако не всегда виновата именно аналитическая колонка. Подобные симптомы могут возникать из-за мелких частиц в пробе, загрязненной защитной колонки, осажденных солей буфера или засорений в инжекторе и трубках. Замена колонки без выявления первопричины может привести к повторным проблемам с последующими колонками.
Частой причиной засорения является загрязнение, поступающее из мобильной фазы. Мельчайшие частицы из растворителей, буферных растворов, стеклянной посуды, резервуаров или трубопроводов для растворителей могут проникать в систему и оседать на фильтре на входе в колонку. Эта проблема может развиваться постепенно и оставаться незамеченной до тех пор, пока не произойдет заметное повышение давления. Этот риск можно снизить, фильтруя мобильную фазу через мембрану с размером пор 0,22 или 0,45 мкм, закрывая колбы с растворителями крышками и регулярно очищая резервуары.
Не менее важную роль играет правильная подготовка проб. В образцах могут содержаться белки, масла, полимеры, вспомогательные вещества, нерастворенные соединения или другие компоненты матрицы. Даже невидимые частицы могут накапливаться на входе в колонку после многократных введений. Как правило, перед введением образцы следует центрифугировать и фильтровать, а концентрированные или сложные образцы, возможно, потребуют разбавления. Прозрачный вид не гарантирует отсутствия частиц в образце.
Проблемы могут возникать и из-за растворителя образца. Если образец подготовлен в сильном органическом растворителе, при попадании в исходную, преимущественно водную, подвижную фазу может произойти осаждение. Образовавшийся осадок может скапливаться вблизи входа в колонку, вызывая повышение давления. Чтобы этого избежать, убедитесь, что растворители образцов совместимы с начальной подвижной фазой, и поддерживайте объемы впрыска в разумных пределах — особенно если проблемы с давлением возникают только с одним конкретным образцом или методом.
Осаждение буферной соли часто приводит к резкому повышению давления. Такая ситуация может возникнуть при прямом переходе от буферизованной подвижной фазы к фазе с высоким содержанием метанола или ацетонитрила. Чтобы предотвратить подобные проблемы, перед переходом на растворители с высоким содержанием органических компонентов необходимо промыть систему совместимым растворителем, не содержащим солей. Эта мера предосторожности имеет решающее значение при работе с концентрированными фосфатными или другими буферами, растворимость которых в органических смесях ограничена.
Повышенное давление не всегда свидетельствует о повреждении самой аналитической колонки. Чтобы точно определить место сужения, остановите насос, дождитесь, пока давление упадет до нуля, отсоедините аналитическую колонку, подключите систему с помощью подходящего соединителя и запустите насос с уменьшенным расходом. Если давление нормализуется без колонки, проверьте аналитическую колонку, защитную колонку и впускную фитру. Если высокое давление сохраняется, проверьте инжектор, седло иглы, пробоотборную петлю, трубки, встроенный фильтр, выпускное отверстие насоса и проточную ячейку детектора.
Отслеживание динамики давления может дать ценную информацию. Постепенное повышение давления, как правило, свидетельствует о накоплении загрязнений в результате многократных впрысков, тогда как резкий скачок часто указывает на наличие частиц, осаждение солей буфера или забитый впускной фильтр. Если высокое давление наблюдается исключительно при одном методе, необходимо проверить состав мобильной фазы, концентрацию буфера, растворитель образца и объем впрыска. И наоборот, если это влияет на все методы, проверьте все компоненты, общие для тракта потока ВЭЖХ.
При подозрении на засорение колонки следует приостановить процессы впрыска и снизить скорость потока. Сначала необходимо осмотреть защитную колонку и, при необходимости, заменить её, поскольку загрязнение в этой колонке может имитировать проблемы с аналитической колонкой, вызывая повышение давления. При проведении необходимой очистки следуйте инструкциям производителя, используя только подходящие растворители. Хотя некоторые колонки допускают обратную промывку для удаления частиц с входного фильтра, проводите её только в том случае, если это явно рекомендовано производителем.
Анализ динамики давления может дать ценную информацию. Постепенное повышение давления, как правило, свидетельствует о накоплении загрязнений в результате многократных впрысков, тогда как резкий скачок часто указывает на такие проблемы, как закупорка частицами, осаждение солей буфера или забивание впускного фильтра. Если при использовании конкретного метода наблюдается высокое давление, следует проверить состав подвижной фазы, концентрацию буфера, растворитель образца и объем впрыска. Если это происходит при всех методах, сосредоточьтесь на общих компонентах всего тракта ВЭЖХ.
При подозрении на закупорку колонки прекратите дальнейшие инъекции и уменьшите расход. Начните с проверки защитной колонки; её замена может устранить проблемы с высоким давлением, которые часто ошибочно принимают за неисправности аналитической колонки. Если возникла необходимость в очистке, следуйте рекомендациям производителя колонки и используйте только совместимые растворители. Некоторые колонки допускают обратную промывку для удаления частиц с входного фильтра, но это следует делать только в том случае, если это явно разрешено производителем. Если после этих проверок давление остается аномальным, осмотрите трубки и соединения или обратитесь к надежному Поставщик фитингов для ВЭЖХ для совместимых запасных частей.